Aktivity nervových buněk poprvé pozorovány v mozku živého savce

26. února 2012

Vědci z Institutu Maxe Plancka vyvinuli mikroskop, díky němuž je možno získat a zaznamenat obrázky z mozku živých zvířat s dříve nedosažitelným rozlišením méně než 70 nanometrů. To umožňuje sledovat přímo, jak nervové buňky v mozku vzájemně komunikují, jak vytvářejí nová spojení, nebo jak některá spojení zanikají. S tímto přístrojem tak neurovědci mohou zase o něco lépe odhalovat, jak mozek funguje.

Snímek nervové buňky v horní vrstvě mozku živé myši ukazuje dříve nezobrazitelné podrobnosti jako velmi jemné dendritické výběžky tzv. trny. Jeden z těchto trnů s houbovitou hlavou je vypíchnut v rámečku.

Optické mikroskopy dosud užívané pro pozorování buněk umožňují rozlišení 200-300 nanomentrů, které je limitováno polovinou vlnové délky viditelného světla. Pro větší detaily se používají mikroskopy elektronové. Pro takové pozorování musí být ale vzorek speciálně upraven například zmražením nebo obarvením. Pro pozorování živých tkání in vivo je proto tato metoda nepoužitelná.

Stefan Hell a jeho tým z Institutu pro biofyzikální chemii Maxe Plancka v německém Göttingenu pracovali řadu let na mikroskopech s ultra vysokým rozlišením známými pod zkratkou STED. K překonání uvedeného limitu využívají kvantového charakteru ﬂuoroforů, tedy látek schopných v závislosti na frekvenci absorbovaného světla buď emitovat záření, nebo zůstat utlumené. Tyto fluorofory je potřeba nejprve vpravit do živých buněk, které chceme pozorovat, v tomto případě tedy do neuronů. Pomocí speciálního laserového svazku se pak dosahuje toho, že prvky umístěné těsně vedle sebe emitují fluorescenci sekvenčně místo simultánně, a tím pádem mohou být opticky rozlišitelné. Výzkumníci byli pomocí této techniky schopni zvýšit rozlišení přibližně na desetinásobek ve srovnání s konvenčními optickými mikroskopy."

STED mikroskopie

STED z anglického Stimulated Emission Depletion, česky doslova stimulovaná emise ztenčení. Jedná se o fluorescenční mikroskopii umožňující dosáhnout rozlišení (30 nm) vyšší než je klasická mez (0,6λ/NA). Princip metody spočívá v tlumení fluorescence excitovaných molekul v krajních partiích stopy (rozptylové funkce) skenujícího laserového svazku a to pomocí dvou časově synchronizovaných a prostorově koincidujících (souosých) laserových pulsů z nichž první (excitační) provádí excitaci fluorochromů a druhý (STED puls) tlumí (ochuzuje) saturací emisi. K tlumení emise dochází v okrajových partiích stopy excitačního svazku, její střed však není tlumen. Dochází tak k podstatnému zmenšení fluorescenční stopy a tím k výraznému zvýšení rozlišení (Point Spread Function engineering)

To, co před pár lety bylo pouhou odvážnou vizí, se nyní stává realitou. Dveře či okna k pozorování živých organismů ve vysokém rozlišení jsou otevřeny. Tým vědců z Göttingenu neváhal a rovnou se s novým zařízením zkusil podívat na nervové buňky živého mozku hlodavců konkrétně myši, která ale musela být pro tento účel geneticky upravená tak, aby její neurony obsahovaly potřebnou fluoreskující látku. V lebce myši poté vyrobili malou skulinku, kterou vyplnili sklem. Aby se mohli soustředit pouze na rozsvícené nervové buňky, byly veškeré ostatní optické informace softwarově odfiltrovávány. Výsledkem byl obraz neuronů nacházejících se ve vnější části živého mozku myši a to v několika násobně vyšším rozlišení než kdy bylo pozorováno.

"S naším STED mikroskopem můžeme jasně vidět velmi jemné dendritické struktury nervových buněk a jejich synapse nacházející se v mozku živé myši. Při rozlišení 70 nanometrů, můžeme také snadno rozpoznat takzvané dendritické trny s jejich houbovitými hlavami," vysvětluje Stefan Hell.

Po několika minutách pozorování se jim naskýtá něco překvapivého. Hlavy dendritických trnů se pohybují a mění svůj tvar. "To je zcela přirozené, že se trny pohybují," říká Katrin Willig. "Tímto způsobem vznikají a zanikají nové spoje. Možná právě vidíme, jak myš myslí," dodává spoluautorka studie, která byla zveřejněna v prestižním časopise Science 3. února 2012 pod názvem Nanoscopy in a Living Mouse Brain.

"Naše současné obrázky ukazují pouze povrh šedé kůry v oblasti mozku, která je zodpovědná za řízení pohybu myši," pokračuje dále Katrin Willig, "nicméně se speciálními implantáty by bylo možné proniknout hlouběji a pozorovat činnost dendritických trnů u zvířat při vědomí a v pohybu."

reklama

"V budoucnu by nám tyto super-ostré a pohyblivé snímky měly ukázat, jak jsou v dendritech distribuovány určité bílkoviny do míst kontaktů," dodává Stefan Hell. Jeho tým je přesvědčen, že možnost pozorování stále větších detailů, vrhne více světla na složení a funkci synapsí na molekulární úrovni.

Tyto poznatky by mohly také pomoci k lepšímu pochopení nemocí, které jsou způsobeny poruchami synapsí, jako jsou například autismus či epilepsie. Jak Stefan Hell vysvětluje: "Díky STED mikroskopii a její aplikaci v živých organismech, bychom měli nyní být schopni poprvé v historii získat optický přístup k těchto nemocem na molekulární úrovni."

Stefan Hell jako jeden ze dvou zástupců Göttingen Research Center Molecular Physiology of the Brain financovaného Německou výzkumnou nadací je zavázán ke spolupráci na dalším výzkumu. On a jeho tým společně s dalšími neurobiology a neurology plánují převést jimi dosažený pokrok v technologii zobrazování do základních znalostí o fungování našich mozků.

Na zmíněné studii zveřejněné časopisem Science se kromě již zmíněných Stefana Hella a Katrin Willig podíleli dále Sebastian Berning, Heinz Steffens a Payam Dibaj.